本发明公开了一种gRNA,所述gRNA序列如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示,本发明还公开了重组质粒、ORF016基因缺失型山羊痘病毒株及其制备方法和应用。本发明首次通过基因敲除方法获得了ORF016基因缺失型山羊痘病毒株,该方法是首次将CRISPR技术在山羊痘病毒中进行应用,同时本发明采用了反向转染方法对ORF016基因进行了敲除,该方法的敲除效率达到了同时,本发明所获得的SDLVDUORF016毒株是一株仅缺失ORF016的毒株,基因的缺失对其生长特性没有影响,该毒株可用于山羊痘疫苗、检测试剂、山羊痘病毒鉴定等用途。